山東帕克環(huán)保工程有限公司

　　1 引言

　　抗生素在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和獸藥上的過度使用導(dǎo)致全球范圍內(nèi)的抗生素抗性菌(以下簡(jiǎn)稱“抗性菌”)廣泛傳播.目前，抗性菌傳播已成為全世界面臨的一個(gè)嚴(yán)重健康隱患，在土壤、水體或空氣等不同環(huán)境介質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)有較高比例的抗性菌或抗性基因存在.例如，對(duì)北京溫榆河流域水體中抗生素抗性大腸桿菌進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水體中各類抗生素抗性大腸桿菌普遍存在，并且許多菌株同時(shí)具有對(duì)多種抗生素的抗性.

　　作為各種污水和排泄物的集中處理場(chǎng)所，城市污水處理廠是抗生素及抗性菌的匯集地.研究表明，城市污水處理廠出水中存在相當(dāng)比例的抗性菌，是導(dǎo)致自然水體抗性菌污染的一個(gè)重要污染源.因此，研究和認(rèn)識(shí)污水處理廠出水中抗生素抗性菌的種類和特性，對(duì)于污水處理和回用的生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和控制十分重要.目前，關(guān)于污水處理廠排放抗性菌的研究大多針對(duì)總異養(yǎng)菌群開展，缺乏關(guān)于菌種構(gòu)成和特性的報(bào)道，因此，有必要加強(qiáng)相關(guān)研究.

　　四環(huán)素類抗生素在我國作為人用或獸用藥品被廣泛使用.本研究從城市污水處理廠二級(jí)處理出水中分離出21株四環(huán)素抗性菌株，在鑒定抗性菌菌屬的基礎(chǔ)上，考察各菌株的生長(zhǎng)特性和對(duì)6種常用抗生素(青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素和利福平)的耐藥性，以期為評(píng)估我國污水處理廠抗性菌風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

　　2 材料與方法

　　2.1 水樣

　　試驗(yàn)水樣取自北京市某城市污水處理廠的二級(jí)處理出水，該污水處理廠主體工藝采用A2/O工藝.取樣設(shè)備均經(jīng)過消毒處理，樣品保存于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于4 ℃冰箱，在4 h內(nèi)進(jìn)行抗性菌分離工作.

　　2.2 抗性菌的分離與菌屬鑒定

　　采用涂布法將二級(jí)處理出水接種于含16 mg · L-1四環(huán)素的營養(yǎng)瓊脂(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15)中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后，挑取單個(gè)菌落于含16 mg · L-1四環(huán)素的營養(yǎng)瓊脂上劃線分離2次.

　　將所分離的菌落進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)試(TaKaRa公司).測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行比對(duì)，獲取菌株的分類菌屬.

　　2.3 抗性菌的質(zhì)粒檢測(cè)

　　將所分離獲得的菌落接種于含16 mg · L-1四環(huán)素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5)中，過夜培養(yǎng)16 h，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)對(duì)新鮮菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取后，采用瓊脂糖凝膠電泳確定質(zhì)粒是否存在.

　　2.4 抗性菌生長(zhǎng)特性 2.4.1 抗性菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

　　將所分離的菌落接種于含16 mg · L-1四環(huán)素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，每2 h測(cè)定OD600，12 h后每隔4~8 h測(cè)定OD600，至菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期.

　　2.4.2 抗性菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定

　　四環(huán)素抗性菌的生長(zhǎng)曲線呈S型，用S-Gompertz模型進(jìn)行擬合，獲得四環(huán)素抗性菌的最大生長(zhǎng)量、最大比生長(zhǎng)速率和遲滯時(shí)間.S-Gompertz模型是細(xì)菌生長(zhǎng)曲線擬合的常用模型，具體數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

　　式中，N為某生長(zhǎng)時(shí)間t下細(xì)菌懸濁液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(cm-1);N0為細(xì)菌懸濁液在600 nm波長(zhǎng)下的初始吸光度值(低于檢測(cè)限，則初始值定為0.001)(cm-1);Nm為細(xì)菌的最大生長(zhǎng)量，即細(xì)菌懸濁液在600 nm波長(zhǎng)下的最大吸光度值(cm-1);μm為細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率(h-1);λ為遲滯時(shí)間(h);t為生長(zhǎng)時(shí)間(h).

　　2.5 四環(huán)素抗性菌對(duì)6種典型抗生素的耐受性分析 2.5.1 抗生素母液配制

　　分別配制濃度為2048 mg · L-1的青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素和利福平水溶液.溶液采用高純水配制，所配溶液用0.22 μm濾頭過膜除菌后，-20 ℃保存，時(shí)間不超過1周.

　　2.5.2 抗生素耐受性試驗(yàn)

　　抗生素耐受性試驗(yàn)采用微量液體稀釋法.將所分離鑒定的菌株接種于含16 mg · L-1四環(huán)素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.所獲得的新鮮菌液接種于含不同濃度梯度抗生素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(采用96孔U型培養(yǎng)板)，在37 ℃經(jīng)18 h培養(yǎng)，測(cè)定OD600.所測(cè)定抗生素包括青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素和利福平;抗生素濃度梯度設(shè)定為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 mg · L-1.

　　2.5.3 抗性菌對(duì)不同抗生素的耐受性評(píng)價(jià)

　　用于評(píng)價(jià)的指標(biāo)主要包括存活率S、最小抑制濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)、半抑制濃度IC50、抗生素抗性指數(shù)(Antibiotic Resistance Index，ARI)、典型病原抗性菌的最小抑制濃度界定最大值MICd，其定義及計(jì)算公式分別如下：

　　式中， OD600ji 為加入抗生素j的第i試驗(yàn)組在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(cm-1)，抗生素j包括青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素和利福平; OD′600ji 為加入抗生素j的第i組培養(yǎng)基在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(cm-1); OD0600 為對(duì)照組(即不加抗生素但加菌液)在600 nm波長(zhǎng)下吸光度值(cm-1); OD′0600 為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在600 nm波長(zhǎng)下吸光度值(cm-1).

　　最小抑制濃度(MIC)定義為存活率小于1%(試驗(yàn)組顯色低于酶標(biāo)儀檢出限)時(shí)抗生素的折點(diǎn)濃度.通過四參數(shù)邏輯斯蒂方程(公式(3))擬合抗生素抑制菌株的劑量效應(yīng)曲線，并通過擬合曲線的參數(shù)確定半抑制濃度IC50，曲線擬合采用Origin8.0軟件完成.抗生素抗性指數(shù)ARI計(jì)算如式(4)所示.

　　式中，A1為無抗生素添加的效應(yīng)值，設(shè)定初始值為100;A2為抗生素添加足夠多時(shí)的效應(yīng)值，設(shè)定初始值為0;x0為半抑制濃度(即IC50)(mg · L-1);x為添加的抗生素濃度(mg · L-1);p為曲線坡度參數(shù).

　　根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)抗生素試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環(huán)素和利福平對(duì)典型病原菌的最小抑制濃度界定(抗性界定)最大值MICd分別為16、32、32、32、16、4 mg · L-1.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 污水處理廠二級(jí)出水中四環(huán)素抗性菌菌種構(gòu)成

　　經(jīng)過3次分離培養(yǎng)，從所選取污水處理廠二級(jí)出水中共獲得21株四環(huán)素抗性菌.16S rRNA鑒定結(jié)果表明，這些四環(huán)素抗性菌株分布于6個(gè)屬，結(jié)果如表 1所示.從分類學(xué)上劃分，這些菌株均屬于腸桿菌(Enterobacteriaceae)科.從菌株數(shù)來看，氣單胞菌屬、埃希氏菌屬和腸桿菌屬細(xì)菌較多.

　　表1 二級(jí)出水中分離出21株四環(huán)素抗性菌的屬分布

　　氣單胞菌屬于革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧條件生長(zhǎng)，屬于條件致病菌，易導(dǎo)致腸胃疾病及傷口感染.檸檬酸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是大腸菌群中的一類.腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧條件生長(zhǎng)，屬于衛(wèi)生部發(fā)布的《人間傳染的病原微生物名錄》中第三類病原微生物，常見于尿道和呼吸道感染中.埃希氏菌屬于革蘭氏陰性菌，大部分埃希氏桿菌為非致病性菌，只有少數(shù)(如E.coli O157：H7)具有致病性.哈夫尼菌屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧條件生長(zhǎng)，屬于條件致病菌.克雷伯氏菌屬于革蘭氏陰性菌，是一類常見的條件致病菌，可引起肺部、尿道和軟組織感染.通過以上分析發(fā)現(xiàn)，污水處理廠二級(jí)出水中的四環(huán)素抗性菌大多屬于條件致病菌.這些菌攜帶有抗生素抗性或抗性升高將增加污水處理廠二級(jí)出水的風(fēng)險(xiǎn).

　　3.2 四環(huán)素抗性菌質(zhì)粒攜帶情況

　　對(duì)所分離的四環(huán)素抗性菌進(jìn)行質(zhì)粒提取和凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)21株四環(huán)素抗性菌中有18株(7株氣單胞菌、5株埃希氏菌、2株腸桿菌、2株克雷伯氏菌、1株哈夫尼菌、1株檸檬酸桿菌)攜帶質(zhì)粒，另外2株氣單胞菌和1株腸桿菌不攜帶質(zhì)粒.不同菌種所攜的帶質(zhì)粒大小不一，但均大于2 kb.有關(guān)研究表明，具有四環(huán)素抗性的革蘭氏陰性菌通常含有大質(zhì)粒，且這些質(zhì)粒多為結(jié)合性質(zhì)粒.結(jié)合性質(zhì)粒具有攜帶多種抗性基因(如其他類型抗生素、抗金屬基因)和病原因子基因(如毒素基因)的潛力.與其他類型質(zhì)粒相比，結(jié)合性質(zhì)粒具有較強(qiáng)的傳播能力.因此，城市污水處理廠出水中四環(huán)素抗性菌所攜帶質(zhì)粒可能導(dǎo)致抗生素抗性基因的傳播.

　　3.3 四環(huán)素抗性菌生長(zhǎng)特性

　　抗性菌的生長(zhǎng)特性能夠反映其在環(huán)境中的增殖能力.本文分別測(cè)定了21株四環(huán)素抗性菌的生長(zhǎng)曲線，并用S-Gompertz模型(公式(1)和(2))擬合，獲得各菌株最大生長(zhǎng)量(Nm)、最大比生長(zhǎng)速率(μm)和遲滯時(shí)間(λ)，具體如表 2所示.

　　表2 四環(huán)素抗性菌的最大生長(zhǎng)量(Nm)、最大比生長(zhǎng)速率(μm)和遲滯時(shí)間(λ)

　　由表 2可以看出，所分離的四環(huán)素抗性菌的最大生長(zhǎng)量(以O(shè)D600計(jì))在1.0~2.3之間，氣單胞菌、埃希氏菌的平均最大生長(zhǎng)量顯著高于腸桿菌(p<0.05)，其他菌株間的最大生長(zhǎng)量無顯著差別.這表明氣單胞菌和埃希氏菌利用碳源和合成菌體的能力更強(qiáng)、效率更高，也可能是這些菌在污水處理廠出水中種類數(shù)上占有優(yōu)勢(shì)的原因.四環(huán)素抗性菌的最大比生長(zhǎng)速率在0.6~3.49 h-1之間，氣單胞菌的最大比生長(zhǎng)速率顯著低于埃希氏菌和檸檬酸桿菌(p<0.05)，其他菌種間的最大比生長(zhǎng)速率無顯著差別.各菌屬的遲滯時(shí)間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差別，大部分菌株的遲滯時(shí)間在2 h以內(nèi).從單一菌種來看，個(gè)別菌株的遲滯時(shí)間較長(zhǎng)，有3株氣單胞菌的遲滯時(shí)間大于6 h，1株埃希氏菌的遲滯時(shí)間接近10 h.

　　3.4 四環(huán)素抗性菌對(duì)不同抗生素的耐受性 3.4.1 最小抑制濃度

　　從污水處理廠出水中分離出的21株四環(huán)素抗性菌對(duì)6種抗生素的最小抑制濃度分布如圖 1所示.由圖 1可知，所分離的21株四環(huán)素抗性菌中，有20株菌對(duì)氯霉素的MIC和10株(含)以上菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素和頭孢噻吩的MIC不小于1024 mg · L-1，這說明污水中四環(huán)素抗性菌對(duì)氯霉素和β-內(nèi)酰胺酶類抗生素(青霉素、氨芐青霉素和頭孢噻吩)的耐受能力普遍較高.同時(shí)，21株四環(huán)素抗性菌對(duì)四環(huán)素的MIC主要集中在256 mg · L-1左右，對(duì)利福平的MIC呈兩極分布.綜上所述，分離所得的21株四環(huán)素抗性菌對(duì)氯霉素的耐受能力最強(qiáng)，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性次之，對(duì)利福平的耐受性最弱.這與有關(guān)污水處理廠出水中總異養(yǎng)菌群對(duì)不同抗生素耐受性的研究結(jié)果類似.

　　圖 1 四環(huán)素抗性菌對(duì)6種抗生素的最小抑制濃度分布

　　與CLSI試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平對(duì)典型病原微生物的抗性界定濃度相比較，分別有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%四環(huán)素抗性菌株的MIC不小于抗性界定濃度，即所分離獲得的四環(huán)素抗性菌株中分別有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%的菌株具有青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平抗性.因此，污水中的四環(huán)素抗性菌同時(shí)具有多種其他抗生素抗性.

　　3.4.2 抗生素抗性指數(shù)

　　根據(jù)2.5.3節(jié)描述的方法，在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了四環(huán)素抗性菌對(duì)6種抗生素的抗性指數(shù)，結(jié)果如圖 2所示.由圖 2可以看出，污水處理廠二級(jí)處理出水中四環(huán)素抗性菌對(duì)氯霉素和四環(huán)素的抗性分布較為集中，而對(duì)青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩和利福平的抗性分布范圍較寬.從抗性指數(shù)的中值來看，四環(huán)素抗性菌對(duì)不同抗生素的耐受性順序與最小抑制濃度分析結(jié)果基本相同，耐受性由高到低分別為氯霉素、青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、頭孢噻吩和利福平.具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 2 四環(huán)素抗性菌的6種抗生素抗性分布

　　4 結(jié)論

　　1)從北京市某城市污水處理廠出水中分離出21株四環(huán)素抗性菌，經(jīng)鑒定為均為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌，分別屬于氣單胞菌(9株)、埃希氏菌(5株)、腸桿菌(3株)、克雷伯氏菌(2株)、檸檬酸桿菌(1株)和哈夫尼菌(1株).其中，有18株細(xì)菌攜帶有質(zhì)粒.

　　2)21株四環(huán)素抗性菌中，氣單胞菌、埃希氏菌的平均最大生長(zhǎng)量顯著高于腸桿菌.四環(huán)素抗性菌的最大比生長(zhǎng)速率在0.6~2.3 h-1之間，氣單胞菌的最大比生長(zhǎng)速率顯著低于埃希氏菌和檸檬酸桿菌.大部分菌株的遲滯時(shí)間在2 h以內(nèi)，各菌屬間無顯著差別.

　　3)關(guān)于最小抑制濃度和抗性指數(shù)的分析結(jié)果表明，四環(huán)素抗性菌對(duì)氯霉素的耐受能力最強(qiáng)，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性次之，對(duì)利福平的耐受性最弱.75%以上的四環(huán)素抗性菌同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)其它5種抗生素(青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平)具有抗性.